سوال علمی هفته (شماره 2)

سوال:

چرا در الکتروفورز   از  اتیدیوم بروماید  استفاده میشود ؟

جواب:

EtBr  یا اتیدیوم بروماید ، ماده شیمیایی است که در رنگ آمیزی DNA  در عملیات الکتروفورز استفاده می شود . در حالت عادی بدون رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید امکان مشاهده DNA  بروی ژل وجود ندارد.

EtBr  مولکولی است با بار مولکولی مثبت (یک رنگ کاتیونی به حساب می آید)، یعنی بروی آن شارژ مثبت وجود دارد و در بین جفت بازهای DNA قرار می گیرد .

ساختمان DNA

 خاصیتی که EtBr  دارد اینست که با نور ماوراء بنفش بر انگیخته شده و از خود نور نارنجی- قرمز  تولید می کند . این موضوع به ما کمک می کند تا حضور و تجمع DNA را در یک نقطه شناسایی کنیم .

در ضمن به خاطر داشته باشید بجای EtBr  می توانید از متیلن بلو نیز برای رنگ آمیزی DNA  استفاده کنید . روش کار به این صورت است :   بعد از تمام شدن الکتروفورز ، ژل را در محلول 0.02 % متیلن بلو در آب قرار داده ( ۱ ساعت ) سپس با قرار دادن ژل در آب برای مدت یک شب آنرا  رنگبری نمائید . باندها در اندازه   20-50  نانوگرم در هر ستون به راحتی قابل مشاهده هستند .

تذکرمهم:   EtBr  ماده شیمیایی سرطانزا می باشد در هنگام کار با آن از دستکش استفاده کنید .

Taq پلی مراز و مورد استفاده آن :

     تک پلی مراز یا  Taq، یک پلی مراز مقاوم در برابر حرارت است که در PCR  استفاده می شود . برای اولین بار از باکتری    Thermus aquaticus      که در چشمه های آب گرم زندگی می کند جدا گردید . Taq پلی مراز اولین آنزیمی بود که به عنوان آنزیم پایدار در حرارت ناشی از عملیات PCR ( در 95 درجه سانتیگراد برای 40 دقیقه ) شناسایی گردید .

یکی از مشکلات بسیار مهمی که آنزیم Taq پلی مراز دارد اینست که مانند سایر پلی مرازها از خاصیت اگزونوکلئازی اصلاح خطاهای جاگذاری نوکلئوتیدها در جهت '3 به '5 برخوردار نیست . پس نمی توان در آزمایشاتی که مربوط به مولکولار کلونینگ است از این آنزیم استفاده کرد ، چون ممکن است بر اثر خطاهای جاگذاری ، توالی مشابه رشته قبلی را به ما ندهد ( خطاها یک به 10000 است ) . به طور کلی عامل 16% جهشهای نقطه ای در 1 Kb رشته DNA  است . Taq پلی مراز می تواند 1 Kb رشته DNA را در عرض 30 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد تکثیر کند .

همچنین Taq پلی مراز می تواند قطعاتی را با دنباله آدنینی تولید کند . این موضوع در TA کلونینگ کاربرد دارد ، جایی که یک وکتور مثل پلاسمید ( که دارای قطعه تیمین و دنباله آدنینی است که بوسیله PCR بوجود آمده ) برای کلونینگ استفاده می شود .

در بعضی موارد DNA - Pfu  پلی مراز بجای Taq پلی مراز و یا به همراه آن استفاده می شود . این آنزیم بیشتر از Taq پلی مراز مقاوم به گرما بوده و درصد خطاهای آن نسبت به Taq پلی مراز بسیار کمتر است و توانایی پروفریدینگ ویا به اصطلاح خاصیت تصحیح خطاها را از '3 به '5  دارا می باشد .

شایان ذکر است که Pfu پلی مراز را از  Pyrococcus furiosus   استخراج می کنند .

انتقال ژنها به سلولها :

  یک روش مستقیم برای انتقال ژنها :

     یک تکنیک بسیار رایج برای انتقال ژن به سلول , ماکروپروجکتایل (Microprojectile) یا بمباران زره ای (Particle bombadment)  است . اساس این تکنیک بر پایه تفنگ ژنی (Gene gun) بوده که در شکل زیر مشاهده می کنید .

    وکتور حاوی ژن مورد نظر (YFG=Your Favorite Gene)  به همراه ذرات طلا و یا تنگستن بر اساس حرکت ذرات باردار در خلاء ، به سمت سلول یا بافت مورد نظر شلیک شده و در آن جای می گیرد .  در بیشتر حالات در این روش DNA بصورت گذرا در ژنوم قرار می گیرد و بیان می شود و پایدار نیست و پس از مدتی از ژنوم خارج شده و از بین می رود . در بعضی موارد مشاهده شده در درصدهای ضعیفی ژن بصورت پایدار یکپارچه شده و بیان می شود .

   مشکل اصلی این روش اینست که احتمال وارد شدن چندین نسخه از یک ژن به داخل یک سلول وجود دارد . همچنین این سیستم نیاز به باز زایی و تکثیر گیاهی در آزمایشگاه دارد و مستقیم نمی توان گیاه  را وارد محیط خارج از آزمایشگاه (In vivo)  کرد .

 

Central dogma of molecular biology:

  :Central dogma of molecular biology

تا آماده شدن مطلب منتظر باشید